مقیاس خطی و لگاریتمی

تفاوت نمایش داده بصورت خطی(Linear) و لگاریتمی:

مقیاس داده در نمودار های فلوسیتومتری به دو دسته خطی و لگاریتمی تقسیم می شود. درک مفهوم این دو در تفسیر داده ها اهمیت دارد.

📈مقیاس خطی اطلاعات مناسبی بدست می دهد اما اگر جمعیت ها مقادیر بسیار متفاوت شدت فلورسانس داشته باشند نمایش آنها در یک نمودار با مقیاس خطی میسر نیست و همزمان هر دو جمعیت منفی و مثبت را نمی توان در روی محور مشاهده نمود. در این موارد بهترین مقیاس ،لگاریتمی است

📉 بصورت تیپیک،جهت ارزیابی تفرق نوری(FSC و SSC) برای اغلب سلول ها مقیاس خطی استفاده می شود.در مورد میکروپارتیکل ها و باکتری ها چون سینگال تفرق نور ضعیف است مقیاس لگاریتمی کارآمد تر است.

🚨برای ارزیابی فلورسنس جمعیت هایی که تفاوت قابل توجه شدت سیگنال دارند مقیاس لگاریتمی استفاده می شود. که می تواند ناشی از یک رنگ آمیزی ایمونوفلورسنس ، پروتئین فلورسنس، رنگ آمیزی حیاتی و غیره باشد.

⚠️ یک استثناء در این زمینه بررسی چرخه سلولی است که در این مورد از مقیاس های خطی استفاده می شود تا پیک های مربوط به فازهای مختلف (G1,M,G2) مشخص گردد.

 

 

Cell cycle analysis

۱٫ Fix cells by slowly adding ice-cold 70% ethanol and keep at at 4°C (or -20°C) for >4h. At this point
cells can be stored for months.
۲٫ Spin down the cells (500xg, 5 min) and wash the pellet once with PBS + 2%FCS. Cells fixed with
ethanol usually requires a longer centrifugation time. Be careful when removing the supernatant,
the pellet is easily disintegrated.
۳٫ Treat cells with RNase A. Add 100µl RNase A (for 1×10
6 cells) at a concentration of 1 mg/ml to the
cells and incubate at 37°C for 30 min.
۴٫ Stain the cells with 5-20µg PI in 0,5-1 ml depending on your cell amount. incubate for ≥۳۰ min at RT
protected from light.
۵٫ Analyze your sample on the Accuri, use the flow rate slow and make sure the flow stays under 500
events/s. Gate your cell population in the scatter plot and view the cell cycle as FL3-H using a linear
scale.
NOTE
PI also stains RNA, the RNase treatment is crucial for a nice cell cycle analysis.
PI can also be used as viability dye since PI does not cross the intact cell membrane but enters dead cells
that have damage plasma membranes and stains the RNA and DNA in these cells.
PI is a carcinogen and should be handled with care!