OMIPs چیست

طی دو دهه اخیر پیشرفت های چشم گیری در قابلیت ها سنجش چندپارامتری در فلوسیتومتری و میکروسکوپ فلورسانس صورت گرفته است. برای مثال دستگاههایی تولید شده اند که قادر به ارزیابی ۱۸ فلوروکروم بصورت همزمان می باشند همچنین شرکت های سازنده آنتی بادی و محلول های مورد نیاز نیز کونژوگه های لازم جهت رسیدن به این هدف را تولید می کنند.

با این حال، طراحی و بهینه سازی پنل های چند رنگ فلوسیتومتری کاری زمان بر و پر چالش است. موارد بسیاری در امر بایستی در نظر گرفته شود از جمله تیتراسیون هر ماده، انتخاب بهترین ترکیب  فلورکروم ها (کونژوگه شده به آنتی بادی) و فائق آمدن بر کاهش حساسیت ارزیابی که در این پنل ها ممکن است رخ دهد.

لذا وجود مکانیسم واحد و ثابت شده که از طریق آن اطلاعات پنل های ایمونوفلورسانس در آزمایشگاه های مختلف به اشتراک گذاشته شود ضروری به نظر می رسد. به این منظور از سال ۲۰۱۰ در مجله “Cytometry A” مقالاتی تحت عنوان پنل های ایمونوفلورسانس چندرنگ بهینه سازی شده : ‘‘Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel’’ (OMIP)  به چاپ رسیده است.

هدف از انتشار این مقالات عبارتست از: کاستن زمان طراحی برای محققانی که همان پنل یا مشابه آن را استفاده می کنند، فراهم کردن شرایط برای خلق OMIP های جدید، مهیا کردن مکانیسمی برای انتساب این پنل ها به طراحان آن از طریق citation این مقالات.

بطور خلاصه در هر OMIP موارد زیر باید لحاظ شود:

۱-باید مشتمل بر ۵ رنگ یا بیشتر باشد.

۲-کاملا بررسی شده و بهینه شده باشد.

۳ OMIP – نبایستی بسط مختصر یه پنل به چاپ رسیده باشد.

۴-تمام مواد مورد استفاده بایستی در دسترس عموم( بصورت تجاری یا پروتکل تهیه آن) باشد.

۵- مقاله OMIP بیش از سه نویسنده نداشته باشد.

به منظور استفاده محققان و علاقمندان OMIP های مختلف که با شماره گذاری مشخص می شوند در سایت ما بارگذاری و در دسترس قرار می گیرد.

Lasers for Flow Cytometry

Lasers for Flow Cytometry: Current and Future Trends

Howard M. Shapiro1 and William G. Telford2
۱The Center for Microbial Cytometry, West Newton, Massachusetts
۲Experimental Transplantation and Immunology Branch, National Cancer Institute,
Bethesda, Maryland

Lasers are the principal light sources for flow cytometers. Virtually all cytometers are equipped with at least one (and often many more) lasers. This unit covers the various types of lasers available and the qualities that make them suitable or unsuitable for use in flow cytometers. Also included is a discussion of future directions, particularly in the area of tunable laser development. Practical tips are provided for building multilaser cytometer systems. C 2018 by John Wiley & Sons, Inc.

Download link:Lasers for Flow Cytometry

مقدمه و معرفی OMIPs

طی دو دهه اخیر پیشرفت های چشم گیری در قابلیت ها سنجش چندپارامتری در فلوسیتومتری و میکروسکوپ فلورسانس صورت گرفته است. برای مثال دستگاههایی تولید شده اند که قادر به ارزیابی ۱۸ فلوروکروم بصورت همزمان می باشند همچنین شرکت های سازنده آنتی بادی و محلول های مورد نیاز نیز کونژوگه های لازم جهت رسیدن به این هدف را تولید می کنند.

با این حال، طراحی و بهینه سازی پنل های چند رنگ فلوسیتومتری کاری زمان بر و پر چالش است. موارد بسیاری در امر بایستی در نظر گرفته شود از جمله تیتراسیون هر ماده، انتخاب بهترین ترکیب  فلورکروم ها (کونژوگه شده به آنتی بادی) و فائق آمدن بر کاهش حساسیت ارزیابی که در این پنل ها ممکن است رخ دهد.

لذا وجود مکانیسم واحد و ثابت شده که از طریق آن اطلاعات پنل های ایمونوفلورسانس در آزمایشگاه های مختلف به اشتراک گذاشته شود ضروری به نظر می رسد. به این منظور از سال ۲۰۱۰ در مجله “Cytometry A” مقالاتی تحت عنوان پنل های ایمونوفلورسانس چندرنگ بهینه سازی شده : ‘‘Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel’’ (OMIP)  به چاپ رسیده است.

هدف از انتشار این مقالات عبارتست از: کاستن زمان طراحی برای محققانی که همان پنل یا مشابه آن را استفاده می کنند، فراهم کردن شرایط برای خلق OMIP های جدید، مهیا کردن مکانیسمی برای انتساب این پنل ها به طراحان آن از طریق citation این مقالات.

بطور خلاصه در هر OMIP موارد زیر باید لحاظ شود:

۱-باید مشتمل بر ۵ رنگ یا بیشتر باشد.

۲-کاملا بررسی شده و بهینه شده باشد.

۳ OMIP – نبایستی بسط مختصر یه پنل به چاپ رسیده باشد.

۴-تمام مواد مورد استفاده بایستی در دسترس عموم( بصورت تجاری یا پروتکل تهیه آن) باشد.

۵- مقاله OMIP بیش از سه نویسنده نداشته باشد.

به منظور استفاده محققان و علاقمندان OMIP های مختلف که با شماره گذاری مشخص می شوند در سایت ما بارگذاری و در دسترس قرار می گیرد.

Article: Lasers for Flow Cytometry

Lasers for Flow Cytometry: Current and Future Trends


Howard M. Shapiro1 and William G. Telford2
۱The Center for Microbial Cytometry, West Newton, Massachusetts
۲Experimental Transplantation and Immunology Branch, National Cancer Institute,
Bethesda, Maryland

Lasers are the principal light sources for flow cytometers. Virtually all cytometers are equipped with at least one (and often many more) lasers. This unit covers the various types of lasers available and the qualities that make them suitable or unsuitable for use in flow cytometers. Also included is a discussion of future directions, particularly in the area of tunable laser development. Practical tips are provided for building multilaser cytometer systems.C 2018 by John Wiley & Sons, Inc.

download link: Lasers for Flow Cytometry

 

OMIP-001

The present panel was optimized for the evaluation of
CD4
1 and CD81 T-cell responses to various HIV-1–derived
peptide pools in peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
from HIV-1
1 individuals with differences in clinical progression. It works well with cryopreserved PBMC, and we have
observed similar results with fresh specimens. Other tissue
types have not been tested

مقیاس خطی و لگاریتمی

تفاوت نمایش داده بصورت خطی(Linear) و لگاریتمی:

مقیاس داده در نمودار های فلوسیتومتری به دو دسته خطی و لگاریتمی تقسیم می شود. درک مفهوم این دو در تفسیر داده ها اهمیت دارد.

📈مقیاس خطی اطلاعات مناسبی بدست می دهد اما اگر جمعیت ها مقادیر بسیار متفاوت شدت فلورسانس داشته باشند نمایش آنها در یک نمودار با مقیاس خطی میسر نیست و همزمان هر دو جمعیت منفی و مثبت را نمی توان در روی محور مشاهده نمود. در این موارد بهترین مقیاس ،لگاریتمی است

📉 بصورت تیپیک،جهت ارزیابی تفرق نوری(FSC و SSC) برای اغلب سلول ها مقیاس خطی استفاده می شود.در مورد میکروپارتیکل ها و باکتری ها چون سینگال تفرق نور ضعیف است مقیاس لگاریتمی کارآمد تر است.

🚨برای ارزیابی فلورسنس جمعیت هایی که تفاوت قابل توجه شدت سیگنال دارند مقیاس لگاریتمی استفاده می شود. که می تواند ناشی از یک رنگ آمیزی ایمونوفلورسنس ، پروتئین فلورسنس، رنگ آمیزی حیاتی و غیره باشد.

⚠️ یک استثناء در این زمینه بررسی چرخه سلولی است که در این مورد از مقیاس های خطی استفاده می شود تا پیک های مربوط به فازهای مختلف (G1,M,G2) مشخص گردد.

 

 

Cell cycle analysis

۱٫ Fix cells by slowly adding ice-cold 70% ethanol and keep at at 4°C (or -20°C) for >4h. At this point
cells can be stored for months.
۲٫ Spin down the cells (500xg, 5 min) and wash the pellet once with PBS + 2%FCS. Cells fixed with
ethanol usually requires a longer centrifugation time. Be careful when removing the supernatant,
the pellet is easily disintegrated.
۳٫ Treat cells with RNase A. Add 100µl RNase A (for 1×10
6 cells) at a concentration of 1 mg/ml to the
cells and incubate at 37°C for 30 min.
۴٫ Stain the cells with 5-20µg PI in 0,5-1 ml depending on your cell amount. incubate for ≥۳۰ min at RT
protected from light.
۵٫ Analyze your sample on the Accuri, use the flow rate slow and make sure the flow stays under 500
events/s. Gate your cell population in the scatter plot and view the cell cycle as FL3-H using a linear
scale.
NOTE
PI also stains RNA, the RNase treatment is crucial for a nice cell cycle analysis.
PI can also be used as viability dye since PI does not cross the intact cell membrane but enters dead cells
that have damage plasma membranes and stains the RNA and DNA in these cells.
PI is a carcinogen and should be handled with care!