آنالیز چرخه سلولی

با استفاده از فلوسیتومتری می توان به چهار طریق، چرخه سلولی را بررسی نمود. دو مورد اول بر مبنای آنالیز محتوای DNA سلول با استفاده از رنگ آمیزی با PI یا DAPI و تفسیر هیستوگرام محتوای DNA سلولی می باشد. با استفاده از این رویکرد می توان سلول ها در سه فاز اصلی سلولی (G1, S, G2/M) را بررسی نمود و همچنین امکان بررسی سلول های آپوپتیک با بررسی محتوای DNA تخریب شده، وجود دارد. سومین رویکرد بر مبنای آنالیز دو متغیره محتوای DNA و پروتئین های مربوط به تکثیر سلولی می باشد برای مثال می توان بیان سیکلین D، E، A یا B را در مقابل محتوای DNA سلول بررسی نمود. بدین شکل می توان سلول های فاز G0 را از سلول های فاز G1، سلول های میتوزی یا بیان دیگر پروتئین های داخل سلولی مرتبط با جایگاه چرخه سلولی تشخیص داد. چهارمین رویکرد نیز بر مبنای شناسایی ۵′-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) متصل به DNA سلول های در حال تکثیر استوار می باشد. جهت این کار، جمعیت سلولی را با anti-BrdU-FITC, RNAse  و رنگ آمیزی با PI تیمار می کنند و جمعیت FITC+ را گیت کرده و آنالیز می کنیم. BrdU در اقع یک آنالوگ تیمیدینی است که در اثر افزودن آن به محیط کشت، به سلول ها وارد شده و طی تکثیر سلول ها، وارد ساختمان DNA می شود و بررسی آن در کنار PI پنل مناسبی جهت تعیین  درصد سلول های فاز S می باشد. با افزایش زمان تیمار و تکثیر سلول ها، شدت فلوئورسنت نصف کاسته می شود، چرا که در هر سیکل سلولی میزان میانگین BrdU نصف می شود. در فاز S، فلوئورسنت سبزی از سلول منتشر می شود.

اخیرا به جای استفاده از BrdU از EdU جهت اتصال به DNA استفاده می شود. EdU مانند BrdU یک آنالوگ تیمیدینی بوده و به صورت فعال به سلول ها وارد می شود و در اثر تکثیر سلول ها به ساختمان DNA سنتز شده وارد می شود. جهت تعیین درصد سلول های فاز S، استفاده از آنتی بادی های کونژوگه به EdU رویکرد مناسب تری نسبت به استفاده از رنگ های متصل به  DNA مانند PI, 7-AAD  یا DAPI می باشد. پروتوکل استفاده از EdU نسبتا دشوار و زمان بر بوده و بررسی همزمان دیگر آنتی ژن های سلولی در ترکیب با آن دشوار است.

 

 

 

بررسی آسیب های وارده به DNA با استفاده از مارکر هیستونی

تابش اشعه UV و برخی از مواد منجر به ورود آسیب به DNA سلولی می شود. در واقع در اثر تابش اشعه UV، دایمرهای پیریمیدینی، تیمیدین و سیتوزین ایجاد می شود که نهایتا منجر به پاسخ های سلولی در جمعیت فشرده سازی کروماتین می شود. در اثر فشردگی کروماتین سلولی، پروتئین کیناز های ATM, ATR و DNA-PKcs می شود که پروتئین p53 و سرین ۱۳۹ هیستون H2AX را فسفریله می کند در نتیجه ملکول های مرتبط با ترمی DNA به محل فراخوانی می شود. . با ایجاد هر شکست در DNA دو رشته، هزاران پروتئین H2AX فسفریله می شود، لذا بررسی این ملکول در کنار رنگ های متصل شوند به DNA مانند DAPI با استفاده از فلوسیتومتری می تواند اثر عوامل محیطی و تیمارهای خاص بر DNA را سنجید.

امکان بررسی محتوای DNA سلول همزمان با بررسی دیگر آنتی ژن های سطحی و داخل سلولی وجود دارد. برای مثال می توان از آنتی بادی های کونژوگه به FITC یا APC در ترکیب با الگوی PI/DAPI استفاده نمود.
برای مثال p53 و Bax از جمله آنتی ژن های سلولی مهم در فرآیند آپوپتوز هستند. همچنین آنتی ژن p16 نیز میزان پیری سلولی را نشان می دهد.

 

 

 

با ورود سلول از پروفاز به آنافاز میتوز و میوز، هیستون H3 فسفریله می شود. بنابراین H3 جهت تعیین درصد سلول های فاز m مارکر مناسبی می باشد و فلوسیتومتری با افتراق بین فازهای m و G2 می تواند چرخه سلولی این جمعیت ها را مشخص نماید. می توان از آنتی بادی های کونژوگه به H3 در ترکیب با PI استفاده نمود و بدین ترتیب درصد سلول های فاز M از G2/M قابل تشخصی می باشد.

با استفاده از رنگ پیرونین Y در ترکیب با Hoechst 33342 می توان جمعیت سلولی G0 را از G1 افتراق دارد. چرا که سلول های G0، محتوای RNA کمتری در مقایسه با سلول های فاز G1 دارند.

 

 

 

 

نهفتگی سلولی

از فلوسیتومتری در بررسی میزان نهفتگی سلولی نیز استفاده می شود. فقر غذایی، اشعه گاما و مهارکننده های سیکلین کینازها از جمله عوامل القاگر ورود سلول به فاز G0 است. با تامین مواد غذایی و محرک های موثر سلول مجددا به فاز G1 وارد می شود. محتوای RNA سلولی در نهفتگی سلولی (quiescent ) در مقایسه با پیری سلولی (senescence ) افزایش می یابد و لذا استفاده از پیرونین T با قابلیت اتصال به RNA می تواند جهت شناسایی جمعیت سلولی نهفته مفید باشد. پیشنهاد می شود در کنار پیرونین  Y (در طول موج ۴۸۸ nm تحریک شده و در طول موج ۵۷۵nm نیز باز نشر می تاباند) از Hoechst  ۳۳۳۴۲ نیز استفاده شود.

 

پلوئیدی

پلوئیدی سلولی در حالتی رخ می دهد که سلول های در حال تقسیم فاز G2/M تقسیم نشوند و مجددا دچار تکثیر DNA شوند. این پدیده در سل لاین ها و مگاریوسیت ها دیده می شود. مگاکاریوسیت ها به عنوان پیش سازهای پلاکتی می تواند دچار پلی پلوئیدی ۱۲۸N, 64N, 32N, 16N   و ۸N شوند. جهت بررسی وضعیت پلوئیدی سلول با استفاده از فلوسیتومتری از PI استفاده می شود.