توانایی همزمان اندازه گیری پارامترهای متعدد روی یک سلول، احتمالا قدرتمند ترین جنبه فلوسیتومتری تحلیلی است. این امر باعث می شود که فلوسیتومتری برای طیف گسترده ای از برنامه های کاربردی استفاده شود. شاید رایج ترین کاربرد این تکنیک، تشخیص حضور آنتی ژن بر سطح و یا در داخل سلول است. در هر صورت فلوسیتومتری ممکن است برای آنالیز  محتوای DNA یا RNA و برخی از مطالعات کاربردی بر روی سلول استفاده شود.

Immunophenotyping

رایج ترین کاربرد فلوسیتومتری ایمونوفنوتایپینگ است. این تکنیک جمعیت سلولها را در یک نمونه هتروژن نظیر خون، مغز استخوان و لنف مشخص  می نماید. این جمعیتهای سلولی از طریق آنتی بادی نشاندار شده متصل شونده به ملکول های سطحی سلولها شناسایی می شوند.

Viability

قابلیت حیاتی سلول ها در فلوسایتومتری می تواند با افزودن یکی از رنگ های متصل شونده به DNA در غلظت های نسبتا کم به سوسپانسیون سلولی تشخیص داده شود. رنگ رایج propidium iodide) PI) است اما طیف گسترده ای از رنگ ها قابل استفاده اند، مانند ۷-AAD، DAPI، DRAQ7 (Biostatus) و SYTOX ADDVanced.

Cell cycle analysis

از فلوسیتومتری می توان برای آنالیز تکثیر سلولی استفاده کرد. این کار از طریق تعیین مرحله چرخه سلولی در جمعیتی از سلولهای امکان پذیر است. سلولها را می توان با استفاده از رنگهای فلورسانس متصل شونده به DNA نشاندار کرد و نتیجه ارزیابی نمود.

Intracellular assay

بررسی پروتئین های درون سلولی شامل سیتوکین ها، پروتئینهای مسیر سینگال رسانی نظیرNF-kB  را  می توان با فلوسیتومتری انجام داد.

Apoptosis

آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده، تخریب سلول است که توسط ژن ها هدایت می شود. سلول های آپوپتوتیک می توانند توسط تغییرات مورفولوژیک، بیوشیمیایی و مولکولی مشخص شوند. از این تغییرات می توان به از دست رفتن ساختارهای سطحی سلول، ایجاد اجسام آپوپتوتیک ، حضور فسفاتیدیل سرین در سطح سلول، دناتوراسیون DNA اشاره کرد. بسیاری از این تغییرات می تواند توسط فلوسایتومتری بررسی شود.

Autophagy

یکی از جنبه های فلوسایتومتری بررسی اتوفاژی می باشد. اتوفاژی می تواند در پاسخ به گرسنگی، تجمع پروتئین، استرس شبکه آندوپلاسمیک و اختلال در پروتئازوم به وجود بیاید. اتوفاژی می تواند به عنوان یک مکانیسم بقای سلول عمل کند و  بنابراین از مرگ سلولی جلوگیری کند.

Functional analysis

تغییرات سلولی میتواند توسط فلوسایتومتری بررسی شود. این امر می تواند شامل انواعی از فعالیت های زیستی نظیر تغییر در محتوای کلسیم در پاسخ به آنتاگونیست ها، تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری، تولید گونه های فعال اکسیژن و تولید نیتریک اکساید در طول آپوپتوز باشد.

به علاوه میزان فاگوسیتوز را می توان با استفاده از باکتری های نشاندار شده با مواد فلوروکروم اندازه گیری کرد.

Cell proliferation assay

تکثیر سلولی نیز با استفاده از پروب های فلورسانس نظیر CFSE یا  Qdots قابل  اندازه گیری است. میزان تکثیر سلولها در طول روزهای کشت از طریق ردیابی CFSE که به سلولها اضافه شده است با دستگاه فلوسایتومتر سنجش می شود.

Intracellular Calcium Flux

سلولها با یکدیگر و با محیط پیرامون خود از طریق مسیرهای انتقال سیگنال ارتباط برقرار می کنند. زمانی که این مسیرها فعال می شوند کانالهای کلسیمی متصل به غشاء کلسیم را به داخل سلول پمپ کرده و به سرعت غلظت کلسیم داخل سلولی افزایش پیدا می کند. سطوح بالاتر کلسیم امکان پاسخ سلول به محرکهای خارجی را فراهم می کند. سیتومتر می تواند جریان کلسیم به داخل سلول را پایش کرده و میزان پاسخ سلول به یک محرک را اندازه گیری نماید.

  • Rare event analysis
  • Translocation assay
  • FRET

Bacteria

باکتری ها را می توان از طریق فلوسیتومتری مورد آنالیز قرار داد. رنگهای فلورسانس متعددی را می توان برای تایید حضور باکتری ، قابلیت حیاتی و محتوای DNA و پتانسیل غشایی به کار برد.

  • CBA
  • FlowCytoMix
  • Insects
  • Neurons
  • NADH
  • PrimeFlow RNA
  • Smartflare kits
  • Muse kits

Exosomes

اگزوزوم ها وزیکول هایی هستند که از سلول ها ترشح می شوند. اخیرا از فلوسیتومتری برای مطالعه اگزوزوم ها  استفاده شده است. اگزوزوم ها از طریق بیان آنتی ژن غشایی نظیر CD9,CD81 و CD63 قابل ردیابی هستند.

Cell sorting

این قابلیتی است که در برخی از دستگاههای پیشرفته فلوسیتومتری گنجانده شده است. دستگاه قادر است جمعیت سلولی خاص مد نظر را بصورت فیزیکی جدا در لوله جداگانه جمع آوری نماید. دستگاه مشخصات هر سلول عبوری از مسیر لیزر را ثبت و بر اساس آن جداسازی را انجام می دهد.

 

کاربردهای بالینی فلوسیتومتری:

  • فنوتایپینگ لوسمی ها و لنفوم ها
  • پایش بیماری و بررسی اثر دارو در بدخیمی های هماتولوژیک و بررسی MRD(minimal residual disease)
  • کاربرد در پیوند عضو: شناسایی آنتی بادی های اختصاصی فرد گیرنده علیه سلولهای دهنده ، شناسایی لنفوسیتهای B اختصاصی HLA، تعیین میزان تاثیر داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی، اندازه گیری پاسخ به عفونتهای ویروسی و پیش بینی رد بافت پیوندی یا پذیرش آن.

شناسایی آنتی بادی های ضد HLA   در پیوند عضو: که از طریق روش کراس مچ با استفاده از فلوسیتومتری (flow cytometry cross matching) انجام می شود. سلولهای دهنده عضو پیوندی را با سرم فرد بیمار مجاور کرده و سپس آنتی بادی نشاندار شده فلورسانس علیه آنتی بادی انسانی به آن اضافه می گردد.

شناسایی آنتی ژن های سازگاری HLA در پیوند

  • ارزیابی بیماری های نقص ایمنی: مانند نقص چسبندگی لکوسیتی
  • بیماری های خود ایمنی: شناسایی آنتی بادی های ضد پلاکت و نوتروفیل، شناسایی کمپلکس های ایمنی
  • ایمونوهماتولوژی
  • کار برد در هماتولوژی: بررسی اریتروسیت ها ، لکوسیت ها و پلاکت ها
  • ناهنجاری های ژنتیک نظیر PNH

 

 

  • Immunophenotyping Applications in Hematology
  • erythrocyte analysis
  • leukocyte analysis
  • platelet analysis